流式细胞术（FlowCytometry）是一种用于分析细胞群体的实验技术，能够同时分析单个细胞的多个特性。为了提高检测的灵敏度和准确性，细胞通常需要经过固定（Fixation）和透化（Permeabilization）处理，以便检测细胞内的分子（如蛋白质、DNA、RNA等）。下面是流式细胞术中固定和透化的常见解决方案。
一、固定（Fixation）
固定的目的是保持细胞内的结构和分子状态，防止细胞在实验过程中发生变化，通常使用化学固定剂进行处理。
常用的固定剂：
甲醛（Formaldehyde）
常用浓度：1-4%
作用：甲醛能够通过与细胞内的蛋白质交联，固定细胞的结构。它对细胞膜和细胞内部结构具有较强的穿透性，常用于维持细胞形态和免疫标记物的稳定性。
使用方法：
将细胞悬浮液与适量甲醛溶液混合。
4°C保存固定的细胞，避免固定时间过长，通常固定时间为15-30分钟。
固定后的细胞可用PBS洗涤，并根据需要进行透化处理。
乙醇（Ethanol）
常用浓度：70%（体积分数）
作用：乙醇是一种广泛使用的固定剂，适合固定DNA、RNA等分子，并能固定细胞形态。乙醇的优势在于其良好的穿透性和与细胞膜的作用方式，可以同时破坏细胞膜，适用于之后的透化步骤。
使用方法：
细胞悬浮液加入70%乙醇，轻轻混匀。
在-20°C或4°C保存固定的细胞，常见的固定时间为30分钟到1小时。
固定后的细胞可用PBS洗涤，并进行透化处理。
固定后注意事项：
固定细胞后需要尽快进行透化处理，避免固定过度导致标记失效。
固定过程中要保持温度低（4°C）以减少细胞损伤。
固定剂的浓度和时间对流式细胞术结果有很大影响，需要优化。
二、透化（Permeabilization）
透化的目的是使细胞膜或细胞内的膜结构变得可渗透，从而使抗体或探针能够进入细胞内部，标记细胞内的分子。
常用的透化剂：
TritonX-100
浓度：0.1%-0.5%
作用：TritonX-100是一种非离子表面活性剂，能够有效地破坏细胞膜，使抗体能够进入细胞。它对细胞膜有较强的破坏作用，可以透化大多数细胞类型。
使用方法：
固定后的细胞加入0.1%-0.5%TritonX-100溶液，轻轻混匀。
在室温下孵育10-20分钟，或根据实验需要优化透化时间。
孵育后，细胞用PBS洗涤，去除透化剂。
Saponin
浓度：0.05%-0.1%
作用：Saponin是一种植物来源的透化剂，作用较为温和，常用于细胞内标记物的检测，特别是在对细胞膜破坏较为敏感的实验中。它通过选择性地破坏细胞膜的胆固醇组成，打开细胞膜上的孔隙。
使用方法：
固定后的细胞加入0.05%-0.1%Saponin溶液。
在室温下孵育5-10分钟，透化效果较温和。
孵育后，用PBS洗涤细胞。
Methanol（甲醇）
浓度：100%
作用：甲醇是一种常见的透化剂，特别适用于细胞内蛋白的检测。它通过抽提细胞内的脂质成分，从而使抗体能够进入细胞。甲醇透化较强，但有可能破坏细胞内的某些结构，因此通常用于固定后透化。
使用方法：
固定后的细胞加入冷却的100%甲醇。
在-20°C保存30分钟或更长时间。
完成透化后，用PBS洗涤。
透化后注意事项：
透化时间和浓度过长可能会导致细胞膜或细胞内部结构的过度破坏，影响实验结果。
不同细胞类型对透化剂的反应不同，可能需要优化透化条件。
透化和固定处理后，应尽量避免长时间暴露在室温下，避免细胞损伤。
三、固定与透化的综合流程
细胞培养与收集
收集待检测的细胞，使用PBS洗涤去除培养基。
固定处理
根据实验需要选择固定剂（如甲醛、乙醇等）。
按照推荐的浓度和时间对细胞进行固定。
固定后使用PBS洗涤细胞。
透化处理
根据实验要求选择透化剂（如TritonX-100、Saponin、Methanol等）。
按照推荐浓度和时间对细胞进行透化。
透化后用PBS洗涤细胞，去除透化剂。
抗体染色与检测
固定和透化后的细胞可以进行表面标记或内部分子标记。
使用适当的荧光标记抗体，进行流式细胞术分析。
四、总结
在流式细胞术中，细胞固定和透化是两个非常关键的步骤。固定剂能够保持细胞结构并防止分子降解，而透化剂能够使抗体或其他探针进入细胞，标记内部分子。选择适当的固定和透化条件对于确保实验的准确性和重复性至关重要。因此，建议根据细胞类型、实验目标和抗体性质来优化固定和透化的方案。
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