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ProteanFect Max (PT02) 转染人源CD34+造血干细胞操作攻略
CD34+造血干细胞的分选
对于人源CD34+造血干细胞，合适的培养条件和转染时间对细胞的成功转染非常关键。CD34+造血干细胞分选后需要培养一段时间恢复细胞状态后，以实现较高的转染效率。以来自动员人单采血或脐带血开始，可以使用市面上阳性选择分选试剂盒分离得到CD34+细胞群。本实验所用细胞为动员人单采血，分离试剂为Lymphoprep™（Stemcell，07861），分选试剂盒为CD34 MicroBead Kit, human（Miltenyi Biotec, 130-046-702）。具体实验操作参考其官·方说明书。
注：在红细胞数量较多的情况下，应先分离PBMC，再使用试剂盒进行分选。具体操作应根据所选材料和试剂盒说明书进行细胞分选。
CD34+造血干细胞完·全培养基的配制
SFEM II培养基（Stemcell，09655）和StemSpan™ CC100（Stemcell，02690）以99：1比例充分混合后使用（若添加抗生素则抗生素稀释1000倍），配置完培养基放置于4℃冰箱储存（尽量在1个月内使用完）。
CD34+造血干细胞的培养与传代
1.分选得到的CD34+造血干细胞300 g离心5 min，用1 mL完·全培养基重悬后，取样计数，根据计数结果用完·全培养基重悬到105 cells/mL活细胞密度，接种到T25培养瓶或细胞培养板中培养。
培养容器 | 每孔体积 | 细胞密度 |
T25 | 8.0 mL | 105 cells/mL |
6-well plate | 2.5 mL | 105 cells/mL |
24-well plate | 1.0 mL | 105 cells/mL |
48-well plate | 0.5 mL | 105 cells/mL |
2.3天后补液一次，调整细胞密度至2×105 cells/mL，之后隔天补液调整密度至2×105 cells/mL ，培养时细胞密度控制在1.5×106cells/mL 以内。
注：若不及时补液，细胞状态及后续扩增受不可逆影响。
3.推荐在CD34+造血干细胞分离后培养5-10天进行转染。如果细胞分离后直接转染或细胞传代时间过长后再转染，转染后的细胞活力与转染效率可能会降低或者CD34+造血干细胞比例偏低。对于使用上述动员单采血来源的CD34+造血干细胞，最佳的转染时间点是在分离培养后的第5天。
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使用ProteanFect Max（PT02)进行人CD34+造血干细胞转染
1.转染的核酸：mRNA
2.适合转染的培养基：使用Opti-MEM培养基（或无血清RPMI 1640/无血清DMEM培养基）进行转染。
3.配置ProteanFect Max转染体系：具体详见表1-3。转染体系在配置过程中出现粘稠现象属于正常。
4.转染前细胞准备：确保细胞处于良好生长状态，活率需超过90%。调整细胞转染密度时，避免反复离心，以免延长处理时间，影响细胞活力和转染效率。
5.细胞转染：孵育时间建议保持在15分钟，适当延长时间可提高转染率，但可能影响细胞活力。
6.转染效率与细胞活率检测：使用阳性对照mRNA时，可在转染后5-48小时内观察EGFP的表达。细胞活率可通过镜下观察、台盼蓝、AO/PI染色或流式细胞术等方法检测，若细胞状态良好，镜下观察可见细胞圆润透亮。
表1. ProteanFectMax转染人源CD34+造血干细胞实验操作步骤说明
（以96孔板转染mRNA为例）
操作步骤 | 人源CD34+造血干细胞 |
1 配置ProteanFect Max转染体系 | |
1.1 将Reagent A与mRNA混合 | 在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA，充分混匀（Reagent A使用前需颠倒混匀） |
1.2 加入Reagent B轻柔充分混匀 | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B混匀一分钟（动作轻柔避免产生气泡） |
1.3 加入Reagent C混匀 | 往上述混合物中加入8-13.5 μL Reagent C混匀（动作轻柔避免产生气泡）a |
2 转染前细胞处理 | |
2.1人源CD34+造血干细胞准备（洗涤尽量去除培养基，以免影响转染效果） | 取1×105 CD34+造血干细胞，加入Opti-MEM，300 g离心5分钟，去上清，收集细胞沉淀，加入Opti-MEM重悬再洗涤一次，用20 μL Opti-MEM重悬细胞调至1×10⁷ cells/mL备用 |
3 细胞转染 | |
3.1混合转染体系与细胞 | 将上述ProteanFect转染液与20 µL细胞悬液混合均匀（动作轻柔避免产生气泡） |
3.2 孵育 | 37℃培养箱孵育15分钟 |
3.3 终止反应与洗涤 | 加入至少200 µL完·全培养基，300 g离心5分钟，弃上清（残留约20μL液体） |
3.4 细胞培养与观察 | 加入适量完·全培养基，进行细胞培养，后续可根据实验目的进行基因表达检测 |
a. 由于人源CD34+造血干细胞的个体差异较大建议先加入13.5 μL的Reagent C。如果细胞活率不佳，可将Reagent C的使用量下调至8 μL。
表2. ProteanFect Max转染不同类型核酸的实验操作步骤说明（以96孔板转染为例）
操作步骤 | 人源CD34+造血干细胞 | |
1 配置ProteanFect转染体系 | mRNAa | siRNAb |
1.1 将Reagent A与核酸混合 | 在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA，充分混匀 | 在40 µL Reagent A中加入40 pmol siRNA，充分混匀 |
1.2 加入Reagent B | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B | 往上述混合物中加入1.4 μL Reagent B |
1.3 加入Reagent C | 往上述混合物中加入8 μL Reagent C | 往上述混合物中加入13.5 μL Reagent C |
2转染前细胞处理 | 详见表2 | |
3 细胞转染 | 详见表2 | |
a. 建议mRNA浓度≥1 μg/mL。如需同时转染多个mRNA，为确保在转染多个mRNA时保持高效的转染效果，加入的mRNA总量为0.5 µg。
b. 建议siRNA浓度≥20 μM。如需同时转染多个siRNA，为确保在转染多个siRNA时保持高效的转染效果，加入的siRNA总量为40 pmol。
表3. ProteanFect Max转染不同细胞培养孔板规格的各组分使用量
a. 由于CD34+造血干细胞存在较大个体差异，建议对Reagent C进行多个梯度测试，以综合考虑细胞活率和转染效率，从而选择最佳方案。Reagent C的使用量可低下调至初始量的50%。
细胞活率和表达效率分析
在转染 EGFP mRNA后，可通过台盼蓝染色和流式细胞术对CD34+造血干细胞转染后的细胞活力与转染效率进行分析。首先通过荧光显微镜对转染后细胞的EGFP蛋白质表达、细胞形态和活力进行定性评估（图 1）。同时，收集转染后的细胞进行台盼蓝染色检测活细胞密度，流式染色PE anti-human CD34 Antibody（Biolegend ,343506）以定量分析CD34+造血干细胞的转染效率。细胞收集完成后，离心弃去培养基，用1 × DPBS重悬细胞，加入PE anti-human CD34 Antibody，4℃避光染色15分钟后洗涤去上清，用1 × DPBS重悬细胞，进行流式检测（图2）。
图1. 利用ProteanFect Max转染EGFP mRNA在人源CD34+造血干细胞中的表达。荧光图（左）和明场图（右）显示，ProteanFect Max转染人源CD34+造血干细胞中1天后。绝大部分细胞表达绿色荧光蛋白，说明ProteanFect Max在人源CD34+造血干细胞中中具有较高的转染效率。
图2. 利用ProteanFect Max转染EGFP mRNA在人源CD34+造血干细胞中表达的流式分析图。使用ProteanFect Max转染试剂转染EGFP mRNA，在转染后24小时检测到约有61.9%细胞表达EGFP蛋白。
常见问题
1. 如何提升转染效率
1）延长转染时间：根据细胞状态适当延长转染时间，通常不超过30分钟。
2. 关于试剂盒中阳性对照的使用建议
首·次尝试时，建议设置阳性对照组（EGFP mRNA），以检测实验操作和试剂的有效性。使用96孔板的细胞量即可，节省细胞和试剂。
2. 转染时的细胞数范围
说明书中提供了最佳转染条件下的细胞数量范围，但在特殊情况下，即使细胞数量较少，也可以进行转染。以96孔板为例，建议细胞数量不低于2×105/孔，以确保后续检测的可靠性。
3. 转染后细胞状态与活力
转染后，细胞状态可能与未处理组略有差异。但使用ProteanFect试剂进行转染时，对细胞活力的损伤较小。通常在转染3天后，细胞状态会基本恢复。
4. 转染后细胞离心后看不到沉淀
对于小体积转染体系（如96孔板），离心后细胞沉淀不明显是正常现象。细胞沉淀可能散落在离心管侧壁，不影响后续结果。为减少细胞损失，离心后移液时应避免枪头紧贴底部。
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