ProteanFect贴壁细胞转染攻略|LX2转染操作protocol

   ProteanFect 转染试剂盒是全·球首·款自组装蛋白纳米颗粒核酸转染试剂，专为难转细胞系设计，能够实现卓·越的外源基因递送与表达。作为一种非病毒、非电转、非脂质体的转染试剂，ProteanFect可高效、低毒、简便地将基因递送至细胞中，尤其适用于大片段和多片段基因递送。LX2细胞是一种人类肝星状细胞的永生化细胞系，广泛用于研究肝纤维化、肝损伤、肝脏疾病模型以及药物筛选。LX2贴壁生长，呈上皮细胞样。本文将详细介绍如何使用ProteanFect转染试剂盒实现LX2细胞的高效转染。

LX2细胞的培养

生长培养基成分：DMEM培养基，含10% 胎牛血清和1%双抗。

使用ProteanFect试剂盒转染LX2细胞

1. 适合转染的核酸类型：包括mRNA、siRNA和DNA。

2. 适合转染的培养基：使用Opti-MEM培养基（或无血清DMEM培养基）进行转染。提前预热或恢复至室温。

3. 配置ProteanFect转染体系：具体详见表1-3。转染体系在配置过程中出现粘稠现象属于正常。

4. 细胞准备：确保细胞处于良好生长状态，活率需超过90%。调整细胞转染密度时，避免反复离心，以免延长处理时间，影响细胞活力和转染效率。

5. 细胞转染：对于贴壁细胞，可消化成细胞悬液进行悬浮转染，也可提前种板进行贴壁转染。具体详见表1。孵育时间建议保持在45-60分钟，延长时间可能影响细胞活力。

6. 转染效率与细胞活率检测：使用阳性对照mRNA时，可在转染后5-48小时内观察EGFP的表达。细胞活率可通过镜下观察、台盼蓝染色或流式细胞术等方法检测，若细胞状态良好，镜下观察可见细胞呈现抱团生长状态。

a.ProteanFect转染体系在配置过程中可能会出现一定的粘稠现象，属于正常情况。

b.孵育时间可根据不同细胞类型有所调整，建议孵育时间不超过2小时。

c.使用阳性对照mRNA时，可在转染后5-48小时内观察到EGFP的表达。

a.建议mRNA浓度≥1 μg/μL。如需同时转染多个mRNA，为确保在转染多个mRNA时保持高效的转染效果，加入的mRNA总量为0.5 µg。

b.建议siRNA浓度≥20 μM。如需同时转染多个siRNA，为确保在转染多个siRNA时保持高效的转染效果，加入的siRNA总量为40 pmol。

c.建议DNA浓度≥0.5 µg/µL；如需同时转染多个DNA，为确保在转染多个DNA时保持高效的转染效果，加入的DNA总量不超过0.4 µg。同时，转染效率受DNA质量影响，建议使用无内毒素试剂盒制备DNA，并确保OD值在1.7-1.9之间。使用无核酸酶纯水将DNA稀释至0.5-2 µg/µL的浓度，以提高转染效果并降低细胞毒性。

使用ProteanFect试剂盒转染LX2细胞实例

（1） 转染步骤

（2） 结果分析

在转染 EGFP mRNA或GFP pDNA后，可通过荧光显微镜和流式细胞术对细胞转染后的细胞活力与转染效率进行分析。首先通过荧光显微镜对转染后LX2细胞的EGFP蛋白质表达、细胞形态和活力进行定性评估（图 1）。同时，收集转染后的细胞进行流式检测以定量分析其转染效率。细胞收集完成后，离心弃去培养基，用1 × DPBS重悬细胞，进行流式检测（图2，图3）。

图1. 利用ProteanFect贴壁转染LX2细胞，EGFP mRNA转染后24小时和GFP pDNA转染后48小时的表达荧光图。

图2. 利用ProteanFect贴壁转染LX2细胞，EGFP mRNA转染后24小时和GFP pDNA转染后48小时的表达流式分析图。

图3. 利用ProteanFect悬浮转染LX2细胞，EGFP mRNA转染后24小时和GFP pDNA转染后48小时的表达流式分析图。

常见问题

1. 如何提升转染效率

延长转染时间：根据细胞状态适当延长转染时间，通常不超过2小时。

2. 质粒DNA转染要求

转染效率受DNA质量影响。建议使用无内毒素试剂盒制备DNA，并确保OD值在1.7-1.9之间；使用无核酸酶纯水将DNA稀释至0.5-2 µg/µL的浓度。

3. 细胞系转染前处理

1）为获得良好的转染效率，建议使用活性超过90%的细胞，可以通过台盼蓝染色测定细胞活性。2）不建议使用传代次数超过15次的细胞进行实验。3）新复苏的细胞在转染实验前需传代2-3次，待细胞恢复正常生长后使用。

4. 关于试剂盒中阳性对照的使用建议

首·次尝试时，建议设置阳性对照组（EGFP mRNA和GFP pDNA），以检测实验操作和试剂的有效性。使用96孔板的细胞量即可，节省细胞和试剂。

5. 转染时的细胞数范围

说明书中提供了最佳转染条件下的细胞数量范围，但在特殊情况下，如细胞较大，可根据细胞大小降低细胞数以匹配相应培养皿。如果细胞数量较少，也可以进行转染。以96孔板为例，建议细胞数量不低于4×10³/孔，以确保后续检测的可靠性。

6. 转染后细胞状态与活力

转染后，细胞状态可能与未处理组略有差异。但使用ProteanFect试剂进行转染时，对细胞活力的损伤较小。通常在转染后第二天，细胞状态会基本恢复。

7. 转染后细胞离心后看不到沉淀

对于小体积转染体系（如96孔板），离心后细胞沉淀不明显是正常现象。细胞沉淀可能散落在离心管侧壁，不影响后续结果。为减少细胞损失，离心后移液时应避免枪头紧贴底部。

8. 转染体系扩大是否影响转染效率

如转染细胞量较大，推荐使用离心管进行孵育，转染体系参照表3，不会影响转染效率。

ProteanFect试剂盒类型及适用细胞系

现有的六款转染试剂盒：

1. PT01--ProteanFect 转染试剂盒

2. PT02--ProteanFect Max转染试剂盒

3. PT03--ProteanFect Max小鼠原代免疫细胞转染试剂盒

4. PT04--ProteanFect CRISPR Cas9基因编辑转染试剂盒

5. PT05--ProteanFect CRISPRMax Cas9基因编辑转染试剂盒

6. PT06-ProteanFect CRISPRMax Cas9小鼠原代免疫细胞基因编辑转染试剂盒

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