人间充质干细胞无血清培养基

   间充质干细胞无血清培养基是 为扩增从骨髓、脐带血或脂肪组织提取的人类间充质干细胞（human mesenchymalstem cells, hMSC）而设计的无血清培养基。该人间充质干细胞培养基化学成分明确，所有组分为化学合成或重组纯化的蛋白，并且无异源蛋白，不含直接从任何动物组织提取成份。因此它不存在批间误差和潜在的动物源性病原体。如果配合使用特定的培养板（见下），还可以省去铺板的工序和时间，免去铺板胶的费用。

一 人间充质干细胞培养基配制：

1. 2‐8℃解冻添加物。

2. 无菌条件下配制100ml间充质干细胞无血清*培养基。

3.如果需要也可加入抗菌素（自选）。

配制好的间充质干细胞无血清*培养液（包含基础培养基、添加物、谷氨酸盐）2-8℃ 避光保存，保存期1 个月。

二 培养基的使用：

培养于其它无血清或有血清培养基的MSCs 可以快捷方便地转换到本品中培养。多数情况下，生长状态良好的MSCs直接换液为本品即可。个别情况下，可能需要逐步转换，如按20%，40%，60%，80%，100%依次递增，至zui终*使用本品。

三 StemRD hMSCs细胞的复苏：

1.37℃水浴快速复苏冻融细胞。

2.将细胞转移到无菌50ml离心管中。

3.逐滴向装有1ml细胞液的离心管中加入10ml预先复温的间充质干细胞无血清*培养基，注意边加边轻轻晃动离心管。

4.将上述混合溶液转移到细胞培养瓶或细胞培养板中。

5.在5%CO2，37℃培养箱中静置培养。

6.培养24h，换液。

7.此后每隔2天换液，直到传代培养。

四 StemRD人间充质干细胞无血清培养基传代培养：

如果使用特定的细胞培养板，如BD PrimariaTM 系列产品或Corning CellBINDTM 系列产品，那么使用本产品培养间充质干细胞是不需要预先铺板。传统的细胞培养瓶和培养板是否无需铺板正在评估中。对于那些还没有被评估的产品或不适用于不预先铺板工序的产品，推荐使用人纤维连接蛋白（Fibronectin）进行铺板。

1.在镜下观察（使用本产品或其它培养基）细胞，确定传代的时间，推荐在细胞量达到70%满的时候传代，不要让细胞超过80%满！

2.预先将0.05%胰酶/0.53mM EDTA和间充质干细胞无血清*培养基复温到37℃待用。

3.用移液枪吸走旧培养基。

4.用DPBS洗一遍（自选）。

5.加入0.05%胰酶/0.53mM EDTA液以覆盖住细胞表面，推荐室温消化细胞（消化液用量：6孔板每孔约10cm2加入0.5ml，25cm2培养板加入1ml）。

6. 镜下观察细胞，当看见细胞开始从培养板底脱离，轻轻敲击培养板边缘帮助细胞脱落。消化时间为1‐3分钟。

7. 加入2倍于消化液体积的间充质干细胞无血清*培养基，将细胞悬液收集于15ml离心管中。

8.1200rpm离心10分钟。

9.尽量弃去离心后的上层清液。用间充质干细胞无血清*培养基重悬细胞。此时可取细胞悬液进行细胞计数。

10.按照3-5X103/cm2密度接种细胞。

11.5%CO2，37℃培养箱中培养。

12.每隔2天换新鲜的间充质干细胞无血清*培养基。

13.当细胞生长达到70%满时，传代（一般每隔3-4天）。

五 冻存细胞：

1.配制细胞冻存液。

2.离心分离细胞，用冻存液重悬细胞。

3.将冻存管转移到冻存盒中，置于-80℃冰箱。

4.将细胞转移到液氮罐中长期贮存。