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干细胞搜网实验室人员教您如何做好 上皮细胞培养：

1）表皮细胞培养
1．取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5～1平方厘米小块。
2．EDTA处理：先置入0.02％EDTA中室温置5分钟。
3．冷消化：换入0.25％胰蛋白酶中，置4℃过通宵。
4．分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与层分开。
5．温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30～60分钟。
6．用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。
7．培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。

2） 乳腺组织培养
直接培养法：（适于培养含纤维少的软组织）
1．在含有少量培养液或Hanks液的容器中，用锋利刀片将组织反复切割成碎块。
2．把组织碎块连同液体注入离心管中，再补加少许培养液，用吸管吹打片刻，置试管架3～5分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复2～3次。
3．末次处理结束后，向沉降管中再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉降物重悬。不待细胞团块下降立即通过3～4层无菌纱布滤入另管中。
4．调整好适宜密度，接种入培养瓶中培养。

胶原酶消化法：（适于处理含纤维多的较硬组织）
其过程与培养其它组织相同。

3） 胃上皮细胞培养
1．取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。
2．清洗：用含庆大霉素（400微克/毫升）和二性霉素（2微克/毫升的Hanks）液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm3大小。
3．消化：在I型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80分钟。
4．离心：收集细胞悬液，800转/分离心后，Hanks液漂洗两次。
5．接种：末次离心后加入含有1％～2％胎牛血清的*培养基，接种入不同孔数的培养板中，接种量依不同实验目的而定。

4） 肝细胞培养
初代组织块培养：
取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3左右的小块，采用帖壁培养法。

初代消化法培养：
1．把肝组织切成2～4立方毫米的小块，用不含钙镁的BSS液洗两次。
2．移入1：1的0.1％胰蛋白酶和0.1％胶原酶（都用无钙镁BSS配置）中，4℃冷消化10～12小时后，通过250微米和64微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。
3．收集细胞、BSS液洗1～2次、计数、接种培养。
消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法；肝脏灌流需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。
1．无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS洗除血污。
2．取5ml注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入肝管系统，并不时轻揉压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；消化液在肝内停留20～30分后，在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。
3．待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI 1640培养基培养（较其它培养基为好），能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。